Lukas Schröer, Alexander Bach, Johanna Oellers, Moritz Nabel, Ameli Kirse, Lucas Stratemann, Andreas Toschki und Martina Roß-Nickoll

Inhalt

1 Einleitung

Böden sind facettenreiche Ökosysteme mit vielen Funktionen, darunter Lebensraum- und Stoffkreislauffunktionen. Zugleich bilden Böden die Lebensgrundlage für die meisten Landpflanzen. Gesunde Böden sind also ein wichtiger Faktor im Aufbau pflanzlicher Biomasse, die das Fundament für natürliche Nahrungsnetze bildet und auch von entscheidender Bedeutung für die Nahrungsmittelerzeugung ist. Im Kontext des Klimawandels gewinnt die Rolle von Böden zusätzlich an Relevanz. Durch die Bildung von Humus können sie etwa CO₂ binden und fungieren so als wichtiger Speicher für Kohlenstoff (Flessa et al. 2019). Eine nicht angepasste Bewirtschaftung aber im Gegenteil auch zu Humusabbau und einer daraus folgenden Freisetzung von CO₂ führen. Entscheidend hierbei ist die Bodenzönose bestehend aus Makro- und Mesofauna (Abb. 1), Mikroorganismen, Pilzen und Pflanzenwurzeln, die diese Bodenprozesse (z. B. Humusaufbau) ermöglichen und regulieren (Turbé et al. 2010; Nabel et al. 2021).

Abb. 1: Organismen der Makro- und Mesofauna eines terrestrischen Lebensraums: Aufnahmen verschiedener Vertreter der drei untersuchten Organismengruppen Regenwürmer (Lumbricidae), Hornmilben (Oribatida) und Springschwänze (Collembola). a) Octolasion cyaneum als Vertreter der Lumbriciden, b) Collembole der Gattung Tomocerus, c) Hypochthoniella pallidula als Vertreter der Oribatiden und d) Collembole der Gattung Orchesella.

(Fotos a, b, d: Hubert Höfer, Foto c: Andreas Toschki)

Fig. 1: Organisms of the macro- and mesofauna of a terrestrial habitat: Photographs of various representatives of the three groups of organisms studied: earthworms (Lumbricidae), oribatid mites (Oribatida) and springtails (Collembola). a) Octolasion cyaneum as a representative of the Lumbricids, b) Collembola of the genus Tomocerus, c) Hypochthoniella pallidula as a representative of the Oribatids and d) Collembola of the genus Orchesella.

Besonders seit einigen Jahrzehnten sehen sich Bodenzönosen verstärkt Stressoren ausgesetzt, darunter finden sich die Intensivierung der Landwirtschaft über Düngung, Bodenbearbeitung und hohen Pestizideinsatz sowie die Auswirkungen des Klimawandels (Nabel et al. 2021). Um diese Veränderungen anhand von Messdaten erfassen und wirksame Maßnahmen in Politik und Praxis ergreifen zu können, bedarf es eines geeigneten Monitorings, dem durch den Aufbau eines nationalen Bodenmonitoringzentrums Rechnung getragen wird (NMZB 2022; Ballasus et al. 2024 in dieser Ausgabe). So können Daten gewonnen werden, die es ermöglichen, langfristig die Entwicklung der Bodenbiodiversität zu dokumentieren sowie die damit zusammenhängenden Auswirkungen auf Bodenfunktionen zu erforschen und entsprechende Indikatoren abzuleiten.

Vor diesem Hintergrund wird derzeit das Projekt BioDivSoil durchgeführt, das zum Ziel hat, verschiedene Organismengruppen durch unterschiedliche Methoden in einem einheitlichen Studiendesign zu erfassen sowie hinsichtlich ihrer Eignung als Indikatoren untereinander zu vergleichen und zu bewerten. Dabei kommen sowohl morphologische Bestimmungsmethoden als auch molekularbiologische Verfahren zum Einsatz (DNA-Metabarcoding). Im vorliegenden Beitrag werden erste Ergebnisse dargestellt. Insbesondere wird dabei der Frage nachgegangen, inwieweit das Metabarcoding sowohl von environmental DNA (eDNA) als auch von Bodenfallenbeifängen geeignet ist, im Rahmen eines Bodenbiodiversitätsmonitorings morphologische Bestimmungen zu ergänzen.

Aktueller Stand des Metabarcodings

Das Prinzip des (eDNA-)Metabarcodings ergänzt die etablierten ökologischen Methoden mit molekularbiologischen und bioinformatischen Ansätzen (Deiner et al. 2017; Schenekar 2023). Dazu werden aus Sammelproben verschiedener Fallen (z. B. Malaise- oder Barber-Falle) oder Umweltproben (Wasser, Boden etc.) DNA-Extrakte gewonnen (Taberlet et al. 2012; Kirse et al. 2021). Die darin enthaltenen genetischen Sequenzen von Interesse werden mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt, um ausreichende DNA-Mengen für die anschließende Sequenzierung zu erhalten. Nach bioinformatischer Aufbereitung werden die Sequenzdaten mit Gendatenbanken abgeglichen, um die Sequenzen spezifischen Taxa zuordnen zu können (Zinger et al. 2019). Die Sequenzen werden entweder in sog. operational taxonomic units (OTU) gruppiert, wobei eine Grenze für die Nukleotidüberschneidungen zwischen verschiedenen Sequenzen festgelegt wird, oder als amplicon sequence variants (ASV) aufgelistet, wenn sich zwei Sequenzen in mindestens einem Nukleotidbaustein voneinander unterscheiden (Callahan et al. 2017).

In verschiedenen Bereichen der Ökologie, bspw. in der Biodiversitätsforschung oder zur Entdeckung invasiver Arten, werden DNA-basierte Identifikationsmethoden bereits erfolgreich eingesetzt (Smart et al. 2015; Port et al. 2016), wobei insbesondere die Anwendung in aquatischen Lebensräumen weit fortgeschritten ist (Pawlowski et al. 2018; Leese et al. 2021). So kann z. B. der ökologische Zustand eines Gewässers minimal-invasiv bewertet werden (Hempel et al. 2020).

Metabarcoding kann auch ein hilfreiches Werkzeug für das Monitoring epi- und endogäischer Bodenorganismen sein, dessen volles Potenzial bisher aber nur unzureichend ausgeschöpft werden kann (Kestel et al. 2022). Ein Grund dafür ist u. a. die Komplexität der Bodenmatrix, was Extraktion und Reinigung der DNA erschwert und zu einer Vielzahl unterschiedlicher Methoden ohne einheitliche Standardisierung geführt hat (Dopheide et al. 2019; Guerrieri et al. 2021). Hinzu kommen die enorme Artenvielfalt von Böden (Anthony et al. 2023) und die im Vergleich zu aquatischen Systemen weniger umfassenden Referenzdatenbanken (Förster et al. 2023). Aufgrund der genannten Punkte stellte die Anwendung DNA-basierter Methoden bei Böden eine besondere Herausforderung dar.

2 Methoden

Innerhalb des Projekts wurden im Frühjahr und Herbst 2021 insgesamt 26 Standorte untersucht, bestehend aus 15 Ackerflächen, 8 grasigen Feldrainen und 3 Grünländern. Die Ackerflächen wurden mit unterschiedlichen Feldfrüchten bewirtschaftet: Mais (5), Wintergerste (3), Raps (2), Winterweizen (2), Sommergerste (1), Kartoffel (1) und Zuckerrübe (1). Bei den Feldrainen handelte es sich um verschieden stark ruderalisierte Glatthafergesellschaften, bei den Grünländern um intensiv bewirtschaftete Wiesen. Die Beprobung erfolgte über einen Zeitraum von sechs Wochen im Frühjahr und Herbst mit drei verschiedenen Methoden. Zum einen wurden pro Fläche vier Barber-Fallen (Barber 1931) eingegraben, um epigäisch aktive Tiere zu fangen. Die damit erfassten Laufkäfer (Coleoptera: Carabidae) und Spinnen (Arachnida: Araneae) wurden morphologisch identifiziert, während die restlichen Beifänge (beschränkt auf Arthropoden) mittels Sequenzierung (Elbrecht et al. 2019) bestimmt wurden. Wird im weiteren Verlauf des Texts vom Metabarcoding der Beifänge gesprochen, bezieht sich dies auf den sequenzierten Arthropodenbeifang exkl. Spinnen und Laufkäfer.

Zur Beprobung endogäischer Springschwänze (Collembola) und Hornmilben (Acari: Oribatida) wurden auf jeder Fläche 10 Bodenkerne bis 5 cm Tiefe entnommen, extrahiert und morphologisch bestimmt. Darüber hinaus wurde aus 20 weiteren Bodenkernen, die nah bei den Bodenfallen und den anderen Bodenkernen lagen, eDNA extrahiert und mittels Metabarcoding analysiert. Regenwürmer (Annelida: Lumbricidae) wurden per Spatenprobe gesammelt (Walter, Burmeister 2019; siehe Kasten 1) und ebenfalls morphologisch bestimmt. Die in den Metabarcoding-Ansätzen enthaltenen Regenwurmarten waren keine Zielorganismen des gewählten CO1-Primerpaars, wurden aber dennoch mit betrachtet, da die CO1-Region auch zur Unterscheidung von Regenwurmarten genutzt werden kann (Soumya et al. 2022). Für eine genauere Beschreibung der Fang- und Extraktionsmethoden siehe Tab. 1 und Kasten 2).

Kasten 1: Erfassung leicht gemacht – Schnellansprache zur Regenwurmhäufigkeit für Äcker.

Box 1: Sampling made easy – Rapid assessment for earthworm frequency in arable fields.

Regenwürmer erfüllen wichtige Funktionen für die Bodenfruchtbarkeit und sind Zeiger für einen biologisch aktiven Boden. Ein guter Regenwurmbestand im Boden fördert auch die oberirdische Biodiversität in der Kulturlandschaft, da Regenwürmer die Beute vieler Tiere sind, z. B. von Vögeln oder Großlaufkäfern. Die genaue Erfassung der Regenwurmanzahl im Boden ist sehr aufwändig. Für Äcker wurde deshalb untersucht, wie gut eine einfache Schnellansprache die Anzahl der Regenwürmer im Boden wiedergeben kann. Dazu wurde von 2012 bis 2022 auf 47 Acker-Bodendauerbeobachtungsflächen (Acker-BDF) in Bayern ergänzend zur umfangreichen Standardmethode (zehn Stichproben mit Austreibungsmethode à 0,5 m² und einer Handauslese von je 0,1 m² je Stichprobe) am selben Tag eine einfache Schnellansprache zur Regenwurmabundanz (Anzahl der Individuen pro m²) durchgeführt. Insgesamt waren es 55 Parallelerhebungen, wobei ein Teil der Acker-BDF in dem langen Zeitraum mehrmals beprobt wurde.

Regenwurmschnellansprache für Äcker

Die Erhebungen fanden zur Aktivitätszeit der Regenwürmer (Frühjahr oder Herbst) innerhalb einer homogenen Ackerfläche von ca. 1.000 m² bei feuchten Bodenbedingungen und einer Bodentemperatur von 5 – 15 °C statt. Die regelmäßig bearbeiteten Äcker wiesen keine raue Furche auf. Zum letzten Pflügen betrug der Abstand mindestens sechs Wochen. Für die Schnellansprache wurden zufällig verteilt 5 – 8 Bodenblöcke mit einer Länge, Breite und Tiefe von je ca. 18 cm × 18 cm × 25 cm ausgehoben. Zur Orientierung diente die Fläche eines Spatenblatts von 18 × 25 cm. Das Bodenmaterial wurde von Hand zerkrümelt und die darin gefundenen Regenwürmer wurden gezählt. Die Flächengröße je Stichprobe betrug ca. ¹/₃₀ m². Multipliziert man den Mittelwert aus den Stichproben mit 30, erhält man die ungefähre Individuenanzahl pro m². Wurden im Mittel 4 – 5 Individuen je Spatenprobe gefunden, waren es also 120 – 150 Regenwürmer pro m², was der durchschnittlichen Regenwurmabundanz für bayerische Äcker entspricht (Walter, Burmeister 2022).

Vergleich der Schnellansprache mit der Standardmethode

Die über die beiden Methoden erfassten Werte der Regenwurmabundanz korrelierten stark (Korrelationskoeffizient: r = 0,93, p < 0,01) miteinander. Auch die Lage der Regressionsgerade im Streudiagramm – nahezu auf der Winkelhalbierenden (Abb. K1-1) – weist auf eine hohe Übereinstimmung der beiden Methoden hin (Bestimmtheitsmaß R² = 0,87). Den genaueren Wert ergibt die umfangreiche Standardmethode mit ihrer größeren Stichprobenzahl und -fläche und der ergänzenden Austreibungsmethode zur Erfassung tiefgrabender Arten. Zur Bewertung, wie gut die Schnellansprache zur Erhebung der Regenwurmabundanz ist, kann die prozentuale Abweichung der Ergebnisse der Schnellansprache von den Ergebnissen der Standardmethode dienen. Dazu wurde die Differenz der anhand der beiden Methoden ermittelten Abundanzwerte für jede Parallelerhebung gebildet (Abundanz nach der Schnellansprache minus Abundanz nach der Standardmethode) und jeweils die positive oder negative prozentuale Abweichung bezogen auf die Standardmethode berechnet (Abb. K1-2). Eine sehr geringe Abweichung der Regenwurmabundanz in der Schnellansprache von weniger als ± 10 % zur Standardmethode war in 38 % der Erhebungen feststellbar. Knapp 30 % der Schnellansprachen wichen ± 10 – 20 % und 22 % wichen ± 20 – 40 % von der Standardmethode ab. Eine Unterschätzung der Abundanz durch die Schnellansprache trat ähnlich häufig auf wie eine Überschätzung. Die mittlere relative Unterschätzung der Abundanz durch die Schnellansprache lag mit 18 % auf ähnlichem Niveau wie die mittlere relative Überschätzung. Allerdings war bei geringen Regenwurmabundanzwerten die relative Abweichung der Schnellansprache zur Standardmethode tendenziell größer als bei hohen Abundanzwerten.

Abb. K1-1: Streudiagramm der über zwei unterschiedliche Erfassungsmethoden erhobenen Regenwurmabundanzen von Äckern mit Regressionsgerade.

Fig. K1-1: Scatter diagram of the earthworm abundances in arable fields collected using two different recording methods with a regression line.

Abb. K1-2: Relative Differenz der Regenwurmabundanzen von Äckern, die mit zwei unterschiedlichen Methoden (Standardmethode und Schnellansprache) auf denselben Flächen (n = 55 Parallelerhebungen) ermittelt wurden (Erläuterung der Berechnung siehe Text). Unterhalb der Nulllinie liegende Punkte umfassen Ackerböden, in denen mit der Schnellansprache weniger Tiere als bei Verwendung der Standardmethode gefunden wurden. Bei oberhalb liegenden Punkten wurden mehr Tiere mit der Schnellansprache erfasst.

Fig. K1-2: Relative difference in earthworm abundance determined using two different methods (standard method and rapid assessment) on the same plots (n = 55 parallel recordings) in arable fields (see text for explanation of calculation). Points below the zero line indicate arable soils in which fewer animals were found with the rapid assessment than with the standard method. In points above the zero line, more animals were recorded using the rapid assessment.

Durch die Schnellansprache meist unzureichend erfasst wurde die Artenvielfalt der Regenwürmer. Bei über 70 % der Schnellansprachen lag die Artenvielfalt niedriger als bei der Standardmethode. Insbesondere adulte Tiere der tief grabenden Art Lumbricus terrestris (Tauwurm) wurden selten mit der Schnellansprache gefunden, lediglich 8-mal im Vergleich zu 47-mal mit der Standardmethode.

Fazit

Die Schnellansprache kann die genauere Standardmethode nicht ersetzen. Sie hat deutliche Schwächen in der Erfassung der Artenvielfalt, v. a. in Bezug auf tief grabende Arten. Deshalb ist sie weniger geeignet für Wiesen, die durch eine deutlich artenreichere Regenwurmgemeinschaft mit höherer Abundanz tiefgrabender Arten geprägt sind. Für regelmäßig bearbeitete Äcker liefert die Schnellansprache allerdings sehr gute Anhaltspunkte zur Regenwurmabundanz. Damit können praktizierende Landwirtinnen und Landwirte z. B. erste Anzeichen der Wirkung von Bewirtschaftungsmaßnahmen auf Regenwürmer oder von ungünstigen Entwicklungen der Regenwurmpopulationen im Rahmen des Klimawandels erkennen und ggf. mit geeigneten Maßnahmen gegensteuern.

Literatur

Walter R., Burmeister J. (2022): 35 Jahre Bodendauerbeobachtung landwirtschaftlich genutzter Flächen in Bayern. Bd. 5: Regenwürmer. LfL Schriftenreihe 2/2022: 83 S.

Autorin

Roswitha Walter

Bayerische Landesanstalt für Landwirtschaft

Institut für Agrarökologie und Biologischen Landbau

Lange Point 6

85354 Freising

E-Mail: roswitha.walter@lfl.bayern.de

Kasten 2: Probenahmemethoden.

Box 2: Sampling methods.

1 Morphologische Bestimmung

Die Beprobung der Laufkäfer (Carabidae) und Spinnen (Araneae) erfolgte mit Bodenfallen, die aus jeweils einem Polyvinylchlorid(PVC)-Rohrzylinder mit einem Durchmesser von 9,5 cm bestanden, der ebenerdig in den Boden eingegraben wurde. In die Zylinder wurden Fanggläser mit einer Gummimanschette eingesetzt. Als Regenschutz diente ein Dach aus durchsichtigem Acrylglas. Als Fangflüssigkeit kam Propylenglykol (99,9 %ig) zur Verwendung, das mit einem unparfümierten Detergens (handelsübliches Spülmittel) zur Brechung der Oberflächenspannung versetzt war. Bei der Leerung der Bodenfallen wurden die Tiere gemeinsam mit der Fangflüssigkeit in ein Vierkantgefäß überführt. Im Labor wurden die Falleninhalte abgesiebt und zur Konservierung in 96 %iges Ethanol überführt. Anschließend erfolgte die Bestimmung der Laufkäfer und Spinnen auf Artniveau mit Hilfe eines (Stereo)mikroskops auf Grundlage des Standardwerks von Müller-Motzfeld (2006) und eines Internetschlüssels (Nentwig et al. 2024).

Weiterhin wurden Springschwänze (Collembola) und Hornmilben (Oribatida) untersucht. Im BioDivSoil-Projekt lag der Fokus auf den endogäischen Arten, die mit Hilfe von Bodenkernen erfasst wurden. Hierbei wurden die Bodenproben mit Hilfe eines Bodenkernstechers entnommen und anschließend im Macfadyen-Extraktor mittels eines Licht-, Temperatur- und Feuchtegradienten ausgetrieben (Macfadyen 1961). Die Bestimmung erfolgte unter dem Mikroskop, wobei als Bestimmungsliteratur die Werke von Weigmann (2006), Fjellberg (1998, 2007) sowie die Bände der „Synopses on Palaearctic Collembola“ (Zimdars, Dunger 1995; Bretfeld 1999; Potapov 2001; Thibaud 2004; Dunger, Schlitt 2011; Jordana 2012) herangezogen wurden.

Für den Nachweis der Regenwürmer (Lumbricidae) haben Walter, Burmeister (2019) eine vereinfachte Methodik zur schnellen und einfachen Ermittlung der Regenwurmdichte in Ackerböden vorgestellt, die auch von den Bewirtschafterinnen und Bewirtschaftern selbst eingesetzt werden kann. Diese Methodik wurde im BioDivSoil-Projekt angewendet. Dabei wurden mit Hilfe eines Spatens gewonnene Bodenproben per Hand im Freiland nach Regenwürmern durchsucht. Die gefundenen Tiere wurden anschließend im Labor auf Artniveau bestimmt. Als Bestimmungsliteratur wurde hauptsächlich das Werk von Sims, Gerard (1999) verwendet.

2 Molekularbiologische Methoden

Für die molekularbiologischen Analysen wurden zum einen die Inhalte von Bodenfallen und zum anderen Bodenkerne verwendet. Bei beiden Herangehensweisen musste im Feld und im Labor darauf geachtet werden, dass keine DNA-Fragmente verschleppt werden. Hierzu wurden die verwendeten Materialien zwischen zwei verschiedenen Proben stets in Chlorbleichlauge eingelegt, um die vorhandene DNA zu entfernen.

Bei der Analyse von Umwelt-DNA (environmental DNA – eDNA) aus den Bodenkernen wurde zur Extraktion ein Phosphatpuffer verwendet (Taberlet et al. 2012). Hierfür wurden 100 g Boden mit 100 ml Pufferlösung versetzt und anschließend für 30 min bei 120 rpm geschüttelt. Anschließend wurden 1,7 ml der flüssigen Phase in Duplikaten in Eppendorf-Gefäße überführt und ab Schritt 8 des NucleoSpin Soil Kit von Macherey-Nagel weiter aufgearbeitet.

Aus den Beifängen der Bodenfallen wurden zunächst die Nichtarthropoden aussortiert. Innerhalb der Arthropoden wurden zwei Größenklassen gebildet (< 6 mm und ≥ 6 mm). Über Nacht wurden die Proben ohne Deckel bei 56 °C im Trockenschrank gelagert, um das Ethanol verdampfen zu lassen. Anschließend wurde ein Lysepuffer (siehe Tab.1) auf die Arthropoden gegeben und die Proben wurden über Nacht mit Deckel bei 56 °C in den Trockenschrank gestellt. Der Überstand wurde nach Protokoll des DNeasy Blood & Tissue Kit von Qiagen weiter prozessiert.

Die erhaltenen Extrakte wurden im Zoologischen Forschungsmuseum Alexander Koenig analysiert. Mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR; Schema in Abb. K2-1 dargestellt) unter Verwendung der spezifischen CO1-Arthropodenprimer fwhF2 und Fol_degen_rev (Elbrecht et al. 2019) wurde die DNA vervielfältigt und anschließend auf der MiSeq-Plattform von Illumina sequenziert. Nach verschiedenen bioinformatischen Aufreinigungsschritten (chimera-detection etc.) der amplicon sequence variants (ASVs) erfolgte ein Abgleich mit der Barcode-of-Life-Data-System(BOLD)-Datenbank. Sequenzen mit einer „Hit ID“ von über 85 % wurden für die weitere Auswertung genutzt.

Abb. K2-1: Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Schema. Dargestellt sind die jeweilige Dauer in Minuten und Sekunden [min:s] und die Temperatur [°C] der einzelnen Schritte (Denaturierung, Hybridisierung und Elongation) innerhalb des PCR-Ablaufs (Graphik mit Canva erstellt).

Fig. K2-1: Polymerase chain reaction (PCR) scheme. The respective duration in minutes and seconds [min:s] and the temperature [°C] of each step (denaturation, hybridisation and elongation) within the PCR process are shown (graphic created using Canva).

3 Ergebnisse

Im Rahmen des Projekts konnten mit allen Untersuchungsmethoden insgesamt genau 1.000 Arten in der Agrarlandschaft nachgewiesen werden. Dabei wurden 300 Arten morphologisch bestimmt (Collembola, Oribatida, Lumbricidae, Carabidae, Araneae), mit Hilfe des Metabarcodings der eDNA wurden 160 Arten identifiziert und über das Metabarcoding der Arthropodenbeifänge 697 Arten. Mit der morphologischen Bestimmung wurden 210 Arten, mit der eDNA-Analyse 90 und mit den Arthropodenbeifängen 556 Arten jeweils exklusiv nachgewiesen. Dabei wurden in der Sequenzierung weitere Taxa erfasst, die in erster Linie dem Stamm der Arthropoden angehören (Staphylinidae – Kurzflügelkäfer, Myriapoda – Tausendfüßer etc.), aber auch darüber hinausgehen (Annelida – Ringelwürmer, Ascomycota – Schlauchpilze etc.), da die gesamten Informationen aus der Analyse der vorliegenden DNA genutzt werden sollten.

Bei einem Vergleich der angewendeten Methoden zur Erfassung der Bodenzönose wird offensichtlich, dass die gewählte Methodik einen erheblichen Einfluss auf die ermittelte Artenvielfalt innerhalb der verschiedenen Organismengruppen ausübte (Abb. 2a). Zur besseren Vergleichbarkeit werden daher die folgenden Analysen exemplarisch für drei charakteristische Organismengruppen im Boden (Collembola, Oribatida, Lumbricidae) präsentiert. Die über eDNA bestimmte α-Diversität war, verglichen mit den beiden anderen Verfahren, im Mittel deutlich niedriger. Demgegenüber waren die Artenzahlen aus dem Metabarcoding der Beifänge ähnlich hoch wie die Artenzahlen der morphologisch bestimmten Tiere aus den Bodenkernen und Spatenstichen. Das Metabarcoding lieferte hier ähnliche bis höhere Artenzahlen für Collembolen und Lumbriciden, während Oribatiden weniger zahlreich erfasst wurden.

Abb. 2: Boxplots der Artenzahlen der untersuchten Organismengruppen Springschwänze (Collembola = Coll.), Regenwürmer (Lumbricidae = Lum.) und Hornmilben (Oribatida = Ori.). a) Durchschnittliche Anzahl nachgewiesener Arten innerhalb der jeweiligen Organismengruppe mit den drei Untersuchungsmethoden Metabarcoding von environmental DNA (eDNA), Metabarcoding der Bodenfallenbeifänge und morphologische Bestimmung von Tieren aus Bodenkernen (Collembola, Oribatida) sowie aus Spatenstichen (Lumbricidae). b) Durchschnittliche Anzahl der in den drei Standorttypen Acker, Feldrain und Grünland nachgewiesenen Arten der Organismengruppen Collembola, Lumbricidae und Oribatida.

Fig. 2: Boxplots of species numbers in the study groups: springtails (Collembola = Coll.), earthworms (Lumbricidae = Lum.) and oribatid mites (Oribatida = Ori.). a) Average number of species detected within the respective organism group using three study methods: metabarcoding of environmental DNA (eDNA), metabarcoding of pitfall by-catches and morphological determination of animals from soil cores (Collembola, Oribatida) and spat samples (Lumbricidae). b) Average number of species of the Collembola, Lumbricidae and Oribatida organism groups detected in the three habitat types (arable land, field margin and grassland).

Auch innerhalb der jeweiligen Standorttypen zeigte sich ein ähnliches Bild (Abb. 2b). Hier wurde mit der eDNA im Mittel in allen Standorttypen eine geringere Anzahl an Arten der drei Organismengruppen detektiert. Das Metabarcoding der Arthropodenbeifänge führte im Durchschnitt zwar zu geringeren Artenzahlen als die morphologische Bestimmung, wies aber die mit Abstand größte Varianz innerhalb der jeweiligen Standorttypen auf.

Bei der Bewertung der standortbezogenen α-Diversität der drei untersuchten Organismengruppen zeigten die DNA-basierten Methoden im Vergleich zur morphologischen Bestimmung eine positive Korrelation der jeweiligen Artenzahlen, die allerdings nur beim Metabarcoding der eDNA signifikant war. Deutlich wurde erneut, dass mit Hilfe des Metabarcodings der Beifänge mehr Arten nachgewiesen wurden als mit eDNA-Analysen (Abb. 3).

Abb. 3: Korrelation der Artenzahlen der beiden Metabarcoding-Verfahren mit den Artenzahlen der morphologischen Bestimmung innerhalb der drei untersuchten Tiergruppen Regenwürmer (Lumbricidae), Hornmilben (Oribatida) und Springschwänze (Collembola). Zur Überprüfung auf einen signifikanten Zusammenhang der linearen Korrelation wurden die gepaarten Proben mit einer Spearman-Korrelationsanalyse untersucht. Türkis: morphologische Bestimmung vs. Metabarcoding der Bodenfallenbeifänge (R_Beifänge = 0,34 mit p = 0,087), grau: morphologische Bestimmung vs. Metabarcoding von environmental DNA (eDNA) (R_eDNA = 0,7 mit p < 0,001).

Fig. 3: Correlation of the species numbers of the two metabarcoding methods with the species numbers of the morphological determination within the animal groups studied: earthworms (Lumbricidae), springtails (Collembola) and oribatid mites (Oribatida). To test for a statistical significance of the linear correlation, the paired samples were examined using a Spearman correlation analysis. Turquoise: morphological determination vs. metabarcoding of pitfall trap by-catches (R_by-catches = 0.34 with p = 0.087), grey: morphological determination vs. metabarcoding of environmental DNA (eDNA) (R_eDNA = 0.7 with p < 0.001).

Wie gut die Referenzdatenbanken geeignet sind, auf Grundlage von ASV bei bestimmten Organismengruppen Arten zu identifizieren, wird hier exemplarisch für die Barcode-of-Life-Data-System(BOLD)-Datenbank dargestellt (Abb. 4). Hierfür wurden die Ergebnisse der eDNA-Analysen und des Metabarcodings der Bodenfallenbeifänge (exkl. Spinnen und Laufkäfer) gepoolt. Während von den Regenwurm-ASV über 75 % einer Art entsprachen, konnten bei den Collembolen und Oribatiden nur noch weniger als 25 % der ASV einer Art zugeordnet werden.

Abb. 4: Gegenüberstellung der Gesamtzahl an amplicon sequence variants (ASV) der drei Untersuchungsgruppen Springschwänze (Collembola = Coll.), Regenwürmer (Lumbricidae = Lum.) und Hornmilben (Oribatida  Ori.) und der Anzahl an ASV, die in der Barcode-of-Life-Data-System(BOLD)-Datenbank einem Artnamen zugeordnet wurden. Dargestellt ist die jeweilige Anzahl der ASV gepoolt für das Metabarcoding von environmental DNA (eDNA) und des Bodenfallenmaterials (exkl. Spinnen und Laufkäfer), die mit einer Übereinstimmung von über 85 % (BOLD-Datenbank) einer Art zugeordnet werden konnten.

Fig. 4: Comparison of the total number of amplicon sequence variants (ASV) of the three study groups – springtails (Collembola = Coll.), earthworms (Lumbricidae = Lum.) and oribatid mites (Oribatida = Ori.) – with the number of ASV assigned to a species name in the Barcode of Life Data System (BOLD) database. The respective number of ASV pooled for metabarcoding of environmental DNA (eDNA) and pitfall trap material (excluding spiders and ground beetles) that could be assigned with an agreement of over 85 % (BOLD database) is shown.

Der Einfluss der drei Methoden auf die Erfassung des Artenspektrums innerhalb einer Organismengruppe wird exemplarisch für die Collembolen gezeigt (Abb. 5). Bei insgesamt 59 nachgewiesenen Collembolenarten lag die gesamte Überlappung für die drei Methoden nur bei etwa 13 % der Arten. Jede Methode wies bestimmte Arten exklusiv nach, wobei die meisten Arten durch die morphologische Bestimmung erfasst wurden. Die eDNA aus den Bodenkernen hatte den geringsten Anteil exklusiver Arten. Dabei erweiterten das eDNA- und das Bodenfallen-Metabarcoding zusammengenommen das nachgewiesene Artenspektrum, das nur mit der morphologischen Bestimmung erfasst worden wäre, um etwas mehr als die Hälfte des Arteninventars.

Abb. 5: Venn-Diagramm der Artenzahlen der Springschwänze (Collembola). Dargestellt sind die mit den drei Untersuchungsmethoden Metabarcoding von environmental DNA (eDNA), Metabarcoding der Bodenfallenbeifänge und morphologische Bestimmung von Tieren aus Bodenkernen jeweils exklusiv gefundenen Artenzahlen und die Artenzahlen, die mit jeweils zwei oder allen drei Methoden gefunden wurden.

Fig. 5: Venn diagram of the species numbers of springtails (Collembola). The diagram shows the species numbers found using only one of the three methods – metabarcoding of environmental DNA (eDNA), metabarcoding of pitfall trap by-catches and morphological determination from soil cores – and the species numbers found with two or all three methods in each case.

4 Diskussion

Die etablierten Methoden der Artbestimmung können durch das Metabarcoding schon heute ergänzt werden, so dass es ein Werkzeug zur Ermittlung und Bewertung terrestrischer Biodiversität darstellt (Zizka et al. 2022; Macher et al. 2023). Wie gut die Biodiversität dabei erfasst wird, hängt v. a. von der jeweils untersuchten Organismengruppe ab. Während bspw. Regenwürmer gut mit DNA-basierten Methoden nachgewiesen werden (vgl. auch Lilja et al. 2023), werden v. a. Oribatiden nur unzureichend identifiziert (Abb. 2a). Oribatiden sind ein hochdiverses Taxon im Boden, darüber hinaus auf Grund ihrer geringen Körpergröße nur schwer bearbeitbar. Genetische Studien zeigen dabei immer wieder, dass die bisher bekannte(Horn)milben-diversität noch deutlich unterschätzt wird und es sich bei vielen Morphospezies um kryptische Artkomplexe handeln könnte (Young et al. 2019; Lienhard, Krisper 2021). In Kombination mit unvollständigen Sequenzdatenbanken (Pedersen et al. 2015) führt dies dazu, dass viele DNA-Sequenzen keiner Art eindeutig zugewiesen werden können (Abb. 4) oder möglicherweise auch keine valide Art widerspiegeln, was umgekehrt auch für die morphologische Bestimmung von Milben gilt. Die Kombination aus nicht ausreichend befüllten Sequenzdatenbanken (Tab. 2) und geringem taxonomischem Wissen ist auch in anderen Organismengruppen ein Problem, so dass hier weitere Forschungsprojekte mit integrativen taxonomischen Ansätzen (Hausmann et al. 2020) zukünftige Monitoringprogramme flankieren sollten.

Weiter offen bleibt die Frage, wie gut unterschiedliche Organismengruppen auf Grund ihrer Lebensweise, Größe, Sklerotisierung etc. mit den verschiedenen genetischen Erfassungsmethoden detektiert werden – unabhängig vom Umfang der Referenzdatenbanken. Heine et al. (2021) konnten z. B. für Pilze aufzeigen, dass es nur eine minimale Überlappung zwischen eDNA- und morphologischen Bestimmungsmethoden gab, was jedoch stark von der jeweils untersuchten Organismengruppe abhängig zu sein scheint (Abb. 5). Daher müssen für weitere bodengebundene Organismengruppen paarweise Vergleiche (Barcoding vs. morphologische Bestimmung) durchgeführt werden, um bei Anwendungen nur einer Methode das Ausmaß einer Unterschätzung von Biodiversität zuvor zu bestimmen und dies künftig zu beachten. Genau wie etablierte Untersuchungsmethoden, z. B. Bodenfallen (Erfassung von Aktivitätsdichten) oder Bodenkerne (extrahiert mobile Lebensstadien), weisen auch DNA-basierte Methoden Grenzen und Einschränkungen auf, die es noch besser zu verstehen gilt. Bspw. zeigt das Metabarcoding der Bodenfalleninhalte hier einen hohen exklusiven Anteil an Collembolenarten, die von der Beprobung mit Bodenkernen, Extraktion und morphologischer Bestimmung nicht abgedeckt werden, da mit Bodenfallen eher epigäische Vertreter erfasst werden, während Bodenkerne für den Nachweis endogäisch lebender Arten besser geeignet sind. Dies dürfte auch die Erklärung für die deutlich stärkere Korrelation bei der Bestimmung der α-Diversität zwischen eDNA- und morphologischer Bestimmung im Vergleich zum Bodenfallen-Metabarcoding sein.

Zur Methodenvalidierung wäre es zukünftig sinnvoll, Lebensraumtypen auszuwählen, die einen naturnahen, guten ökologischen Zustand mit hoher Bodenbiodiversität beherbergen, um eine möglichst umfassende Aussage über das Vorkommen von Arten an einem Standort treffen zu können. Die Analyse und Beschreibung dieser „Referenzen“ würden eine methodenspezifische Ableitung von Indikatoren bzw. auch Handlungsempfehlungen für die Erhaltung oder Entwicklung einer „typischen“ Biodiversität in den verschiedenen terrestrischen Lebensräumen ermöglichen. Mit im Durchschnitt weniger als fünf Arten (bezogen auf Regenwürmer, Springschwänze und Hornmilben) auf den Äckern wird deutlich, dass hier nur noch eine stark verarmte Bodenbiozönose vorhanden ist, die sich nicht für solche Fragestellungen eignet. Vor diesem Hintergrund ist es gerade in der Agrarlandschaft wichtig, ein klares Bild des „guten ökologischen Zustands“ eines Standorttyps zu definieren und Referenzstandorte für die gesuchte Biodiversität zu finden. Bei der Verwendung morphologischer Methoden wird dieser Ansatz bereits verfolgt (Toschki et al. 2021). Um Metabarcoding sinnvoll und effektiv im ökologischen Monitoring nutzen zu können, ist dieser Schritt auch hier unbedingt zu empfehlen.

Ein weiteres Problem besteht in der Komplexität der Bodenmatrix, die zahlreiche Schritte zur Extraktion und Reinigung der DNA erfordert. Dies führt zu einer Vielzahl möglicher Methodenkombinationen, was eine vergleichende Betrachtung von Studienergebnissen erschwert (Nagler et al. 2022). Gerade die Weiterentwicklung der Sequenzierplattformen ermöglicht eine deutlich bessere Auflösung der vorhandenen DNA-Sequenzen. Dadurch ergeben sich v. a. mehr Sequenzen aus dem jeweiligen Extrakt, so dass auch DNA-Sequenzen mit einem geringeren Anteil an der gesamten DNA-Menge berücksichtigt und Arten zugeordnet werden können (Pereira-Marques et al. 2019). Eine Standardisierung der Methodik von der Probenahme über die Extraktion der DNA bis hin zur bioinformatischen Verarbeitung bei gleichzeitiger Beachtung der stetigen Weiterentwicklung der Methodik ist hierbei dringend geboten, um Ergebnisse studienübergreifend vergleichbarer zu machen (Leese et al. 2023). Dazu zählt auch, dass erhobene Forschungsdaten entsprechend den FAIR-Kriterien auffindbar(findable), zugänglich (accessible), interoperabel und wiederverwendbar (reusable) sein sollten, wozu entsprechende Datenbankstrukturen geschaffen oder erweitert werden müssen.

Auf Grund der noch bestehenden Unsicherheiten innerhalb der Methodik des Barcodings ist es darüber hinaus notwendig, die identifizierten Arten kritisch zu hinterfragen und mit biogeographischen und ökologischen Kenntnissen abzugleichen, um das Auftreten einer Art auf Plausibilität zu überprüfen. Gerade bei der frühzeitigen Entdeckung invasiver Arten könnte das Metabarcoding zukünftig eine große Hilfe sein. Aktuell bedarf es jedoch noch einer weiteren Überprüfung und Sichtung der potenziell problematischen Arten, um keine Maßnahmen an falscher Stelle einzuleiten (Mahon et al. 2023).

5 Fazit

Das Metabarcoding sowohl von eDNA aus dem Boden als auch von Bodenfalleninhalten ist eine wertvolle Ergänzung zur morphologischen Bestimmung von Tieren nach der Extraktion aus Bodenkernen, die das erfasste Spektrum an Arten erheblich erweitert. Um jedoch eine verlässliche Anwendung im Monitoring zu erreichen, sind immer noch einige Hürden zu überwinden. Besonders hervorzuheben sind die zum Teil mangelhafte Befüllung der Referenzdatenbanken und die bisher nicht quantitativ auswertbaren Daten in Bezug auf Individuenzahlen oder Biomassen. Außerdem ist das taxonomische Wissen über Bodenorganismen teilweise schlecht verfügbar, so dass dieses Wissen im Rahmen eines Bodenbiodiversitätsmonitorings stärker vereinheitlicht und besser zugänglich gemacht werden müsste. Bezüglich der unterschiedlichen Methoden ist eine Validierung erforderlich, die aufzeigt, inwieweit bestimmte Gruppen über- oder unterrepräsentiert erfasst werden. Außerdem sollten bundesweit gültige methodische Standards etabliert werden, um eine Vergleichbarkeit verschiedener Studien untereinander zu gewährleisten.

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Förderung und Dank

Das Projekt „BioDivSoil – Methoden zur Erfassung und Bewertung von Bodenflora und -fauna und deren Funktionen in Agrarökosystemen sowie Entwicklung von Vorschlägen zur gezielten Förderung von Bodenbiodiversität im integrativen Naturschutz in der Agrarlandschaft (FKZ: 3520 84 1700)“ wird vom Bundesamt für Naturschutz (BfN) mit Mitteln des Bundesumweltministeriums (BMUV) gefördert.